E sequenze genomiche di a maiò parte di i virus sò cunnisciute.Sonde d'acidu nucleicu chì sò segmenti brevi di DNA pensati per hibridà cù DNA virali cumplementari o segmenti di RNA.A reazione in catena di polimerasi (PCR) hè una tecnica più efficace per a deteczione virali.Recentemente sò stati sviluppati metudi di diagnosticu à altu throughput.
A. Tecnica di hibridazione di l'acidu nucleicu
L'ibridazione di l'acidu nucleicu, cumpresu principalmente u Southern blotting (Southern) è u Northern blotting (Northern), hè una nova tecnica di sviluppu rapidu in u campu di diagnostica di virus.U ragiunamentu di l'assay d'ibridazione hè di utilizà segmenti brevi di DNA (chjamatu "sonda") cuncepitu per hibridà cù DNA virali cumplementari o segmenti di RNA.Per riscaldamentu o trattamentu alkaline, l'ADN o l'RNA di destinazione à doppia catena sò separati in filamenti unichi è dopu sò immobilizzati nantu à un supportu solidu.Dopu questu, a sonda hè aghjuntu è hibridizata cù l'ADN di destinazione o RNA.Siccomu a sonda hè marcata cù isotopi o nuclidi non radioattivi, l'ADN o l'RNA di destinazione pò esse rilevati per autoradiografia o da u sistema biotina-avidina.Siccomu a maiò parte di i genomi virali sò stati clonati è sequenziati, ponu esse rilevati utilizendu sequenze specifiche di virus cum'è sonde in u specimen.Attualmente, i metodi di ibridazione include: dot blot, ibridazione in situ in cellule, DNA blotting (DNA) (Southern blot) è RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B. Tecnulugia PCR
Nta l'ultimi anni, una seria di tecniche di amplificazione di l'acidu nucleicu in vitro hè stata sviluppata nantu à a PCR, per pruvà virus insensibili o incultivabili.A PCR hè un metudu chì pò sintetizà una sequenza di DNA specifica per a reazione di polimerasi in vitro.U prucessu di PCR include un ciculu termale di trè tappe: denaturazione, annealing è estensione À alta temperatura (93 ℃ ~ 95 ℃), l'ADN à doppia filamentu hè separatu in dui filamenti di DNA unichi;dopu à bassa temperatura (37 ℃ ~ 60 ℃), dui primers di nucleotide sintetizzati anneal à i segmenti di DNA cumplementari;mentri à a temperatura adatta per l'enzima Taq (72 ℃), a sintesi di novi catene di DNA partenu da l'iniziu 3'end usendu DNA cumplementari cum'è mudelli è nucleotidi unichi cum'è materiali.Allora dopu ogni ciculu, una catena di DNA pò esse amplificata in duie catene.Ripitendu stu prucessu, ogni catena di DNA sintetizzata in un ciculu pò esse usata cum'è mudellu in u prossimu ciclu, è u numeru di catene DNA hè radduppiatu in ogni ciculu, chì significa chì a produzzione di PCR hè amplificata in una velocità di log 2n.Dopu à 25 à 30 cicli, a produzzione di PCR hè identificata per l'elettroforesi, è i prudutti specifici di DNA ponu esse osservati sottu a luce UV (254nm).Per u so vantaghju di specificità, sensibilità è cunvenzione, a PCR hè stata aduttata in u diagnosticu clinicu di parechje infizzioni virali cum'è HCV, HIV, CMV è HPV.Siccomu a PCR hè assai sensibile, pò detectà l'ADN di virus à u nivellu di fg, l'operazione deve esse realizata cù cura per evità falsi pusitivi.Inoltre, u risultatu pusitivu in a prova di l'acidu nucleicu ùn significa micca chì ci hè un virus infettivu vivu in a mostra.
Cù una larga applicazione di a tecnica di PCR, novi tecniche è metudi sò sviluppati basati nantu à a tecnica di PCR per diversi scopi di prova.Per esempiu, a PCR quantitativa in tempu reale pò detectà a carica virali;A PCR in situ hè usata per identificà l'infezzione virali in tissuti o cellule;A PCR nidificata pò aumentà a specificità di a PCR.Frà elli, a PCR quantitativa in tempu reale hè stata sviluppata più rapidamente.Parechje tecniche novi, cum'è a sonda d'idrolisi TaqMan, a sonda di ibridazione è a sonda di faro moleculare, sò state cumminate in a tecnica PCR quantitativa in tempu reale, chì hè largamente utilizata in a ricerca clinica.In più di identificà a carica virali in u fluidu di u corpu di i pazienti cù precisione, stu metudu pò ancu esse usatu per detectà mutanti tolleranti à a droga.Dunque, a PCR quantitativa in tempu reale hè principalmente applicata in a valutazione di l'effettu curativu è a vigilazione di a tolleranza di droghe.
C. Deteczione di high-throughput di l'acidi nucleici virali
Per risponde à i bisogni di diagnostichi veloci di e novi malatie infettive emergenti, sò stati stabiliti diversi metudi di rilevazione d'alta produzzione, cum'è chips di DNA (DNA).Per i chips di DNA, sonde specifiche sò sintetizzate è attaccate à picculi chips di siliciu in una densità assai alta per furmà microarray di sonda di DNA (DNA) chì pò esse hibridizata cù mostra.U signale di l'ibridazione pò esse stampatu da un microscopiu confocale o un scanner laser è esse ulteriormente processatu da l'urdinatore è ponu esse ottenuti enormi dati nantu à diversi geni.Ci sò dui tipi di chip DNA.U "chip di sintesi" hè cusì: l'oligonucleotidi specifichi sò sintetizzati direttamente nantu à i chips.Un altru hè u chip di piscina di DNA.I geni clonati o i prudutti PCR sò stampati in modu ordinatu nantu à a diapositiva.U vantaghju di a tecnulugia di chip di DNA hè a rilevazione simultanea di una quantità enorme di sequenze di DNA.L'ultima versione di chip di rilevazione di patogeni pò identificà più di 1700 virus umani à una volta.A tecnulugia di chip di DNA risolve i prublemi di i metudi tradiziunali di hibridazione di l'acidu nucleicu è hà applicazioni assai larghe in u diagnosticu virali è u studiu epidemiologicu.
Tempu di pubblicazione: 23-dic-2020